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作者：解螺旋·貓大

導語

小夥伴們，今天我們來解析一下 Real-Time PCR，從原理到步驟詳解再到數據分析，一個都不能少！

在正式開講之前呢，貓大必須要安利一個網址： http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/ 。對，這就是著名的哈佛引物庫！

目前 PrimerBank 收錄了超過 306,800 對 Real-Time PCR 引物，涵蓋了大部分人類和小鼠基因。小夥伴們可以用 GenBank Accession，NCBI protein Accession，NCBI Gene ID，Gene Symbol，PrimerBank ID 或者關鍵詞去庫里搜索引物。而且還整合了blast 功能，可以拿目的基因序列去 primerbank 的資料庫里進行blast。據說其中收錄的 26,855 對小鼠引物經過 Real Time PCR 驗證後，其中 22,187 對引物是可用的，成功率有82.6%！！！但是貓大建議小夥伴們，在庫里搜索到引物之後呢，別忘了用 oligo 6 評價一下引物，多練習一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。

好，下面開講 Real-Time PCR，我們就從 Real-Time PCR 的發展史說起，包括 Real-Time PCR 的原理，實驗設計，實際操作，數據分析，常見問題解答五個方面，手把手教你從各個方面了解 Real-Time PCR 。由於內容比較多，這五個部分會分成 3 講。首先是 Real-Time PCR 的原理，實驗設計和實際操作。

Real-Time PCR 發展史

Real-Time PCR 的技術的發展是伴隨著 Real-Time PCR 儀的研製。1995 年，美國 ABI 公司（已經併入 Invitrogen 公司）成功研製了 Taqman 技術，並推出了首台螢光定量 PCR 檢測系統 7700，通過檢測每個循環的螢光強度對 PCR 進程進行實時檢測。由於在 PCR 擴增的指數時期，模板的 Ct 值和該模板的起始拷貝數存在線性關係，所以以 Ct 值可進行表達定量。由於 Real-Time PCR 能克服常規 PCR 的缺點，並且具有操作簡便，靈敏度高，重複性好等優點，因此發展非常迅速，從而螢光定量 PCR 獲得廣泛應用。

Real-Time PCR 實驗原理

實時 PCR 就是在 PCR 擴增過程中，螢光信號被收集，轉化為成為擴增和熔解曲線，以實現對 PCR 進程進行實時檢測。具體數據就是基線，螢光閾值和 Ct 值。

Ct 值就是螢光值達到閾值時候的 PCR 循環次數。Ct 值跟初始模板的量成反比。 第 3-15 個循環的螢光值就是基線（baseline），是由於測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的 10 倍。

實驗設計

對於 Real-Time PCR 而言，首先就是實驗材料的處理和準備；然後是引物設計；最後是實驗和數據分析（這一部分單獨說明）。

1. 實驗材料的處理和準備

在第一講 RNA 抽提中已經講過一些，還需要注意的是， 以最基本的基因表達差異分析為例，實驗材料分為對照組（CON）和處理組（TRT）。組內要有復孔，要有生物重複，這樣可以統計分析此處理是否有統計學意義。

2. 引物設計

一般Real-Time PCR 引物的設計遵循下面一些原則：

• 擴增產物長度在 80-150bp。

• 引物應用核酸系列保守區內設計並具有特異性。

• 產物不能形成二級結構。

• 產物長度一般在 15-30 鹼基之間。

• G+C 含量在 40%-60%之間。

• 鹼基要隨機分布。

• 引物自身不能有連續 4 個鹼基的互補。

• 引物之間不能有連續 4 個鹼基的互補。

• 引物 5』端可以修飾。

• 引物 3』端不可修飾。

• 引物 3』端要避開密碼子的第 3 位.

Taqman 探針的設計稍有不同，遵循以下原則：

• 儘量靠在上游引物；

• 長度 30-45bp，Tm 比引物高至少 5℃；

• 5』端不要是 G，G 會有淬滅作用，影響定

操作過程

1. RNA 提取和反轉錄：操作過程及注意事項見第一講。

2. Mix 配製：一般 Real-Time PCR MasterMix 都是 2×的濃縮液，只需要加入模板和引物就可以。由於Real-Time qPCR 靈敏度高，所以每個樣品至少要做 3 個平行孔，以防在後面的數據分析中，由於 Ct 相差較多或者 SD 太大，無法進行統計分析。根據所用 MasterMix、模板和引物的不同進行優化，達到一個最佳反應體系。在反應體系配置過程中，有下面幾點需要注意：

• MasterMix 不要反覆凍融，如果經常使用，最好溶解後放在 4 度。

• 更多的配製 Mix 進行，減少加樣誤差。最好能在冰上操作。

• 每管或每孔都要換新槍頭！不要連續用同一個槍頭加樣！

• 所有成分加完後，離心去除氣泡。

• 每個樣品至少 3 個平行孔。

參比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是 ROX。參比染料的作用是標準化螢光定量反應中的非 PCR 震盪，校正加樣誤差或者是孔與孔之間的誤差，提供一個穩定的基線。現在很多公司已經把 ROX 配製在 MasterMix 或者 Premixture 里。如果反應曲線良好或已經優化好反應體系，也可以不加 ROX 染料校正。

通常來講，Real-Time qPCR 的反應程序不需要像常規的 PCR 那樣，要變性、退火、延伸 3 步。由於其產物長度在 80‐150bp 之間，所以只需要變性和退火就可以了。SYBR Green 等染料法，最好在 PCR 擴增程序結束後，加一個溶解程序，來形成溶解曲線，判斷 PCR 產物的特異性擴增。而溶解程序，儀器都有默認設置，或稍有不同，但都是在產物進行溶解時候，進行螢光信號的收集。

好啦！樣品上機，qPCR儀已經在努力奔跑了，數據出來後我們進入Real-Time PCR 的數據分析階段！

相對於只能半定量的常規PCR而言，qPCR的優點是既可以用於判斷序列的有

無，即定性，也可以用於確定DNA拷貝數，即定量。而且qPCR的結果無需通過電泳，而是通過計算螢光值來評估。由此可見，數據分析在qPCR這項實驗中的份量。

qPCR 的數據分析可以分成相對定量和絕對定量兩種。比如處理組細胞與對照組細胞相比，X 基因的mRNA 改變了多少倍，這就是相對定量；在一定數目的細胞中，X 基因的mRNA 有多少個拷貝，這就是絕對定量。通常我們在實驗室用得最多的就是相對定量的方法，本講將詳細解析相對定量的數據處理。

相對定量的分析結果是在相當量的實驗組和對照組中一個靶基因的相對比率（倍數差異）。這種分析方法是通過等量樣本間比較得到結果，需要進行歸一化處理以確保相比較的兩組樣本具有可比性。通常我們會選擇使用在各個樣品中表達保持不變的基因作為參照基因（內參），用內參的表達水平來進行歸一化處理。

相對定量qPCR

何時選用相對定量qPCR？

如果對 RNA 模板的數量不能精確定量，或者只需要知道目的基因的表達差異時，可以使用相對定量法。

常用的相對定量數據分析方法有：雙標曲線法、ΔCt 法、2‐ΔΔCt法(Livak法 )、用參照基因的ΔCt 法和 Pfaffl 法。

• 雙標曲線法：每次實驗都分別用標準品做內參基因和目的基因的標準曲線， 並同時擴增各待測樣本中的目的基因和內參基因。然後使用標準曲線來計算待測樣本中的目的基因和內參基因的表達量。最後使用如下公式得出目的基因表達差異。

雙標曲線法不受擴增效率差異的干擾。但是對每一個基因，每一輪實驗都必需做標準曲線，而且必需有固定的標準品做標準曲線。

• ΔCt 法：不用內參基因作為標準， 實驗設計簡單，數據分析處理簡單。 需要準確量化初始材料（如細胞數目或核酸微克數），擴增效率為 100%。計算公式如下：

2^‐ΔCt=2^{‐（實驗組 Ct‐對照組 Ct）}

• 2^‐ΔΔCt法：這是最常用的進行相對基因表達分析的方法，得到的結果是實驗組中目的基因相對於對照組中目的基因表達的差異倍數。要求目的基因和內參基因的擴增效率都接近 100%，且相對偏差不超過 5%。計算公式如下：

首先用內參基因的 Ct 值對實驗組(test)和對照組 (con)的靶基因 Ct 值進行歸一化：

ΔCt test=實驗組目的基因 Ct 值-實驗組內參基因 Ct 值

ΔCt con=實驗組目的基因 Ct 值-實驗組內參基因 Ct 值

隨後用對照組的Ct值歸一實驗組的ΔCt：

ΔΔCt=ΔCt test-ΔCt con

最後計算表達水平的差異倍數：

Change Fold=2^‐ΔΔCt

• 用參照基因的ΔCt 法：這個方法的使用前提與2^‐ΔΔCt法相同。計算方法如下：

對照組表達=2^{(對照組內參 Ct‐對照組目的基因 Ct)}

實驗組表達=2^{(實驗組內參 Ct‐實驗組目的基因 Ct)}

這種方法得到的對照組表達水平不是 1.0，但如果將得到的兩個表達值都除以對照組表達值，則得到：

對照組 Ratio=1

實驗組 Ratio

=2^{(實驗組內參 Ct‐實驗組目的基因 Ct)}/ 2^{(對照組內參 Ct‐對照組目的基因 Ct)}

=2‐[(實驗組目的基因 Ct‐實驗組內參基因 Ct)‐ (對照組目的基因 Ct‐對照組內參基因 Ct)]

=2^{‐(ΔCt test‐ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

得到的比值與2^‐ΔΔCt法是相同的，因此用參照基因的ΔCt 法是2^‐ΔΔCt的一種變化形式。

• Pfaffl 法:當目的基因擴增效率(E target)和內參基因擴增效率(E ref)不同，但每個基因在實驗組和對照組擴增效率相同時，可以按下列計算公式確定表達差異。

首先，與 2^‐ΔΔCt法的計算過程一樣，先進行歸一化校準：

ΔCt target=對照組目的基因 Ct‐實驗組目的基因 Ct

ΔCt ref=對照組內參基因 Ct‐實驗組內參基因 Ct

隨後計算表達水平的差異倍數：

Change Fold= (E target)^{ΔCt target}/(E ref)^{ΔCt ref}

如果 E target= E ref=2，那麼 Pfaffl 法就可以簡化為：

Change Fold

=2^{ΔCt target}/2^{ΔCt ref}

=2^{ΔCt target‐ΔCt ref}

=2^{(對照組目的基因 Ct‐實驗組目的基因 Ct)‐(對照組內參基因 Ct‐實驗組內參基因 Ct)}

=2^{‐(ΔCt test‐ΔCt con)}

=2^‐ΔΔCt

因此，事實上，2^‐ΔΔCt法是 Pfaffl 法的簡單特例。

那麼，這些方法我們都必須一一掌握嗎？ NO！只需要掌握最實用的雙標曲線法和2^‐ΔΔCt法就足夠應付所有情況了。